martes, 18 de mayo de 2010

Tarea 4

- Establecer y describir las técnicas de separación que se ha empleado en la determinación del/ de los analito/s en la/s muestra/s del tema asignado a cada grupo.

- Decir en cada caso cual es el objetivo de incorporación de la técnica de separación en cada uno de los casos.

Cromatografía en Capa Fina (CCF)

http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S0798 04692003000100010&script=sci_arttext

Para este método procedimos a la extracción de la cocaína y su principal metabolito: la benzoilecgonina, para esto se alcalinizó la orina hasta alcanzar un pH entre 8 y 9, se agregó 10 ml de cloroformo en un embudo de separación; del extracto clorofórmico se tomó una alícuota de 6 ml, el cual se evaporó a sequedad para posteriormente retomarlo con 0,1 ml de ácido acético 2N para sembrarlo en la cromatoplaca y proceder a la migración de la muestra aplicando el sistema de CCF para bases nitrogenadas.
A pesar que la CCF y la LUV nos han dado buenos resultados para detectar cocaína en muestras biológicas y no biológicas en las cuales las mismas se encuentra en concentraciones relativamente altas, los resultados obtenidos en nuestro estudio nos indican que estas metodologías, tal como las realizamos en nuestro laboratorio, no se pueden emplear para determinaciones presuntivas o de screening en muestras de orina provenientes de pacientes farmacodependientes en proceso de rehabilitación, en las cuales la droga se encuentra en concentraciones relativamente bajas.

Inmunoensayo por fluorescencia polarizada (FPIA)

http://www.sertox.com.ar/retel/n13/retel_n13_004.pdf

Se analizaron individualmente un total de 45 muestras de orina, 20 correspondían
a consumidores de marihuana y 25 a consumidores de cocaína. Luego se hizo un pool de muestra arrojando un volumen entre 80-100 mL. Se tomaron 16 alícuotas de 10 mL cada una, 8 alícuotas del pool que contenía benzoilecgonina (BEC) y 8 alícuotas del pool que contenía delta-9- tetrahidrocannabinol (THC). Estas alícuotas fueron almacenadas en material de vidrio (pyrex) y plástico (polipropileno) a temperaturas de 4 y -20ºC, con y sin fluoruro de sodio (NaF) como aditivo conservador, conocida la concentración inicial (tiempo 0) de ambos metabolitos, se hicieron medidas consecutivas a los 2, 4, 6, 8, 16, 32, 64 y 128 días. Utilizando el método de inmunoensayo TDx, considerando el pH. El equipo utilizado fue un TDx marca Abbott, basado en inmunoensayo por polarización de fluorescencia (FPIA). Todo el material utilizado fue lavado y descontaminado en solución de ácido nítrico al 20%. Las muestras fueron suministradas por pacientes que acuden a nuestra unidad con fines de rehabilitación, casos legales o “screening” laborales.

Fundamento de FPIA

http://www.a14.san.gva.es/labm/fpia.htm

El origen de este ensayo radica en la emisión de luz a distintas longitudes de onda con distintas orientaciones espaciales al azar, desde una lámpara de tungsteno. Dicha radiación se filtra de tal modo que solo pasa luz azul (481-489 nm), la cual a su vez atraviesa un polarizador de cristal líquido para producir un rayo de luz azul polarizada plana que será el que incida sobre la muestra.
Es un inmunoensayo competitivo en el que un antígeno marcado con trazador (fluoresceína) se disputa, con el antígeno presente en la muestra, la unión del anticuerpo específico.
Al incidir la luz emitida sobre el trazador, lo eleva a un estado de excitación, tras el cual dicho trazador vuelve a estado de equilibrio emitiendo luz verde (525-550 nm). Cuando la fluoresceína esta ligada a una molécula de anticuerpo de gran tamaño, su rotación en el seno de la muestra disminuye y permite que la emisión de luz verde sea en el mismo plano de polarización que la radiación recibida, mientras que si dicho fluoróforo está unido solo al antígeno (de pequeño tamaño) la rotación es rápida y cuando emite luz verde lo hace ya en otro plano de polarización.
Todo esto implica que cuanto mayor sea la concentración de antígeno (sustancia a medir) en la muestra, menor será la polarización detectada debido a que existirán menos uniones anticuerpo-antígeno-trazador.
También se deduce del funcionamiento de dicha técnica, que se emplee solamente para moléculas de bajo peso molecular, para que no interfiera su tamaño en una menor rotación del antígeno-trazador libre.

Cromatografía de gas (GC) espectrofotometría de masa (MS)

http://www.usam.edu.sv/SiteUmasferrer/InvetigacionInstitucional/Deteccion%20cocaina%20en%20cabello.pdf

Cromatografía de gases con detector de espectrometría de masas (GCMS).

• Se enfrió e inyectó la alícuota en un cromatógrafo Agilent Technologies 6890 acoplado a un detector selectivo de masas Agilent Technologies 5973 inert. La columna capilar utilizada Columna cromatográfica PE-17 entrelazada 50% fenil y 50% metil polisiloxano (30 metros x 0.32 mm. Diámetro Interno, 0.25 μm5 Grosor de Película).
• La temperatura del puerto de inyección 230° C, en la modalidad sin división de flujo
(splitless), 0.75 minutos la interfase a 280°C.
• El horno fue programado con una temperatura inicial de 100°C con un incremento de 25°C por minuto hasta alcanzar 235° C, temperatura que se mantiene por 20 minutos.
• El gas transportador Helio de extrema pureza se usó a una velocidad de flujo de 50ml/minuto.
• Se utilizó el modo SIM (monitoreo de masa de un solo ión), con 4 iones para identificar la benzoilecgonina.
• Los iones utilizados en el monitoreo fueron: 77, 82, 124 y 168. Por ser estos los iones de la benzoilecgonina que se encuentran en mayor abundancia.6
• El tiempo de retención de la sustancia fue de 16.999 minutos.

http://upcommons.upc.edu/revistes/bitstream/2099/2733/1/5CROMGASES.pdf

La cromatografía de gases

En cromatografía de gases, la muestra se inyecta en la fase móvil, la cual es un gas inerte (generalmente He). En esta fase, los distintos componentes de la muestra pasan a través de la fase estacionaria que se encuentra fijada en una columna. Actualmente, las más empleadas son las columnas capilares.
La columna se encuentra dentro de un horno con programación de temperatura. La velocidad de migración de cada componente (y en consecuencia su tiempo de retención en la columna) será función de su distribución entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Cada soluto presente en la muestra tiene una diferente afinidad hacia la fase estacionaria, lo que permite su separación: los componentes fuertemente retenidos por esta fase se moverán lentamente en la fase móvil, mientras que los débilmente retenidos lo harán rápidamente. Un factor clave en este equilibrio es la presión de vapor de los compuestos (en general, a mayor presión de vapor, menor tiempo de retención en la columna). Como consecuencia de esta diferencia de movilidad, los diversos componentes de la muestra se separan en bandas que pueden analizarse tanto cualitativa como cuantitativamente mediante el empleo de los detectores seleccionados.
Existen tres técnicas básicas de inyección de muestras (líquidas o gaseosas) en columnas capilares: split, split-less y on column. Las dos primeras consisten en inyectar y vaporizar la muestra en una cámara de vaporización. El sistema split desvía la mayor parte de la muestra fuera del sistema cromatográfico y envía sólo una pequeña fracción a la columna. El método split-less dirige toda la muestra a la columna, por lo que resulta más adecuado para el análisis de trazas o de componentes muy volátiles. La inyección oncolumn se lleva a cabo en frío, eliminando la etapa de vaporización que podría producir la descomposición de los compuestos termolábiles.
En ocasiones, por ejemplo en el caso de muestras de tejidos, se desean analizar los componentes volátiles contenidos en muestras sólidas. En tal caso, es necesario efectuar una extracción previa con un disolvente adecuado e inyectar el extracto en la columna. La extracción de espacio en cabeza (HS: “head-space”) es una alternativa más rápida a la extracción en Soxhlet, que además evita la pérdida de los componentes más volátiles. En este método, la muestra sólida se coloca en un vial sellado con un septum y se calienta durante un tiempo determinado a la temperatura fijada. Durante esta operación, la mayor parte de los compuestos volátiles se transfieren al aire del vial, denominado espacio de cabeza. Se calienta el tiempo suficiente para que se alcance el equilibrio. Seguidamente, con una jeringa se toma una alícuota del aire del vial y se inyecta en el cromatógrafo. La aguja de la jeringa debe calentarse a la misma temperatura que la muestra para evitar condensaciones sobre la misma.

La espectrometría de masas

La espectrometría de masas (MS) es una de las técnicas analíticas más completas que existen. Recientemente, esta técnica se utiliza no sólo en investigación, sino también en análisis de rutina de los procesos industriales, en control de calidad, etc.
Sus principales cualidades son:
- Capacidad de identificación de forma prácticamente inequívoca, ya que proporciona un espectro característico de cada molécula.
- Cuantitativa: permite medir la concentración de las sustancias.
- Gran sensibilidad: habitualmente se detectan concentraciones del orden de ppm o ppb y en casos específicos se puede llegar hasta ppt e incluso ppq.
- Universal y específica.
- Proporciona información estructural sobre la molécula analizada.
- Suministra información isotópica.
- Es una técnica rápida: se puede realizar un espectro en décimas de segundo, por lo que puede monitorizarse para obtener información en tiempo real sobre la composición de una mezcla de gases.
Dentro del espectrómetro de masas, se procede a la ionización de la muestra mediante diferentes métodos. El sistema de ionización más frecuente es el de impacto electrónico que bombardea las moléculas con electrones de una cierta energía, capaces de provocar la emisión estimulada de un electrón de las moléculas y así ionizarlas.
Además de moléculas ionizadas o iones moleculares (M+) también se forman iones fragmento debido a la descomposición de los iones moleculares con exceso de energía. El tipo y proporción relativa de cada uno de estos fragmentos es característico de las moléculas analizadas y de las condiciones del proceso de ionización. Una vez ionizadas las moléculas, se aceleran y se conducen hacia el sistema colector mediante campos eléctricos o magnéticos. La velocidad alcanzada por cada ión será dependiente de su masa. La detección consecutiva de los iones formados a partir de las moléculas de la muestra, suponiendo que se trate de una sustancia pura, produce el espectro de masas de la sustancia, que es diferente para cada compuesto químico y que constituye una identificación prácticamente inequívoca del compuesto analizado. El espectro de masas puede almacenarse en la memoria del ordenador para compararse con los espectros de una colección de espectros (o librería) y proceder a su identificación o puede estudiarse para averiguar la naturaleza de la molécula que le dio origen, etc.

Acoplamiento cromatografía de gases-espectrometría de masas

La cromatografía de gases es una técnica separativa que tiene la cualidad de conseguir la separación de mezclas muy complejas. Pero una vez separados, detectados, e incluso cuantificados todos los componentes individuales de una muestra problema, el único dato de que disponemos para la identificación de cada uno de ellos es el tiempo de retención de los correspondientes picos cromatográficos. Este dato no es suficiente para una identificación inequívoca, sobre todo cuando analizamos muestras con un número elevado de componentes, como es frecuente en cromatografía de gases capilar.
Por otra parte, la espectrometría de masas puede identificar de manera casi inequívoca cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz de identificar los componentes individuales de una mezcla sin separar previamente sus componentes, debido a la extrema complejidad del espectro obtenido por superposición de los espectros particulares de cada componente.
Por lo tanto, la asociación de las dos técnicas, GC (“Gas Chromatography”) y MS (“Mass Spectrometry”) da lugar a una técnica combinada GC-MS que permite la separación e identificación de mezclas complejas.
La utilización de la cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masas requiere sistemas especiales de conexión. En principio, se trata de dos técnicas que trabajan en fase gaseosa y necesitan una muy pequeña cantidad de muestra para su análisis, por lo que son muy compatibles.
El único obstáculo serio a la hora de realizar su acoplamiento es que el efluente que emerge de la columna cromatográfica sale a presión atmosférica y debe introducirse en el interior del espectrómetro de masas que trabaja a alto vacío. Actualmente, el acoplamiento directo resulta fácil cuando se utiliza la cromatografía de gases capilar, que es el caso más habitual.
En resumen, una mezcla de compuestos inyectada en el cromatógrafo de gases se separa en la columna cromatográfica obteniendo la elución sucesiva de los componentes individuales aislados que pasan inmediatamente al espectrómetro de masas. Cada uno de estos componentes se registra en forma de pico cromatográfico y se identifica mediante su respectivo espectro de masas.
En este proceso, el espectrómetro de masas, además de proporcionar los espectros, actúa como detector cromatográfico al registrar la corriente iónica total generada en la fuente iónica, cuya representación gráfica constituye el cromatograma o “TIC” (total ion current). En efecto, la corriente iónica generada por todos los iones da lugar a un pico gaussiano de área proporcional a la concentración del compuesto detectado.

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